عنوان

بررسی سطح بیان ژن زیرواحدهای آلفا-2، آلفا-3 و بتا-2 گیرنده های GABAA آمیگدال قاعده ای-جانبی به دنبال تعدیل درد التهابی در رت های نر بالغ

پ۲۹۰۴۰

per

بررسی سطح بیان ژن زیرواحدهای آلفا-2، آلفا-3 و بتا-2 گیرنده های GABAA آمیگدال قاعده ای-جانبی به دنبال تعدیل درد التهابی در رت های نر بالغ

فاطمه ناصری

علوم طبیعی

۱۴۰۲

۱۴۳ص.

سی دی

کارشناسی ارشد

علوم جانوری

۱۴۰۲/۰۶/۰۱

درد پدیده‌ای هشداردهنده است تا با اخطار وجود یا احتمال وجود آسیب‌ بافتی، امکان پیشگیری، حفاظت و/یا درمان فراهم شود. در سیستم عصبی مرکزی، مسیرهای تعدیل‌کننده درد متعددی وجود دارد که مسیر پایین‌روی تعدیل درد، بی‌دردی ناشی از استرس (SIA) و سیستم‌های اوپیوئیدی و کانابینوئیدی اشاره کرد. مطالعات متعددی نشان داده اند که مسیر پائین روی تعدیل درد از هسته مرکزی آمیگدال منشأ می گیرد. هسته مرکزی آمیگدال نیز ورودی های خود را از آمیگدال قاعده ای-جانبی دریافت می-کند. درواقع آمیگدال ورودی‌هایدرد را از تالاموس، قشر حسی-پیکری اولیه و ماده خاکستری دورقناتی (PAG) دریافت می‌کند و ورودی‌هایدریافت شده از PAG در تعدیل پائین روی درد نقش دارند. آمیگدال یک ساختار چندهسته‌ای مغز پیشین و بخشی از دستگاه لیمبیک است که علاوه بر نقش کلیدی در درک احساسات، پاسخ به محرک¬های حسی، پردازش هیجان، عواطف و تعدیل درد دخالت دارد. آمیگدال قاعده‌ای-جانبی فیبرهای عصبی حاوی اورکسین را از هیپوتالاموس جانبی (LA) دریافت می‌کند. نوروپپتیدهای اورکسین A و B، توسط سلول‌های عصبی اورکسینرژیک موجود در هیپوتالاموس جانبی آزاد شده، با اتصال به گیرنده‌های خود مسیرهای سیگنالی داخل‌سلولی را فعال‌ می‌کنند. این پپتید‌ها رفتارهای مختلفی مانند تغذیه، چرخه خواب و بیداری، تعادل انرژی و تعدیل درد را کنترل می‌کنند. گزارشات متعددی نشان می‌دهد که فعال‌شدن گیرنده‌های اورکسین نوع 1 (Orx1R) باعث تولید 2-آراشیدونیل گلیسرول (2-AG) می گردد که بهصورت پس‌گرد سبب مهار رهایش گابا از نورون‌های پیش‌سیناپسی و القای بی‌دردی می‌شود. گاما-آمینوبوتیریک اسید (GABA) مهم‌ترین انتقال‌دهنده عصبی مهاری در سیستم عصبی مهره‌داران است که نقش مهمی در هماهنگی شبکه‌های عصبی موضعی و عملکرد هسته‌های مغزی مختلف ایفا می‌کند. این میانجی عصبی اثر خود را از طریق گیرنده‌هایGABAA ،GABAB و GABAC اعمال می‌کند. گیرنده‌های GABAA از زیرواحدهای مختلفی تشکیل شده است که بیان آن‌ها در نواحی مختلف سیستم عصبی مرکزی متفاوت است. براساس این مطالعات بیان زیرواحدهای α2، α3 و β2 این گیرنده در BLA آمیگدال نشان داده شده است. بنابراین در این مطالعه اثر اورکسین بر روی سطح بیان ژن زیرواحدهای α2، α3 و β2 گیرنده‏های GABAA در آمیگدال قاعده‌ای-جانبی رت های نر بالغ به دنبال تعدیل درد التهابی با کمک تکنیک qRT-PCR بررسی شد.مواد و روش‌ها: در این مطالعه‌، نمونه‌های بافتی آمیگدال قاعده‌ای-جانبی مربوط به 84 سر رت نر ویستار به دوازده گروه هفت‌تایی تقسیم شدند. برای بررسی تغییرات بیان ژن‌های زیرواحدهای α2، α3 و β2 گیرنده‏های GABAA از تکنیک Real Time-PCR استفاده شد. در ابتدا، RNA تام سلولی از نمونه‌های آمیگدال قاعده‌ای-جانبی استخراج گردید. سپس، خلوص RNA استخراج شده توسط دستگاه اسپکتروفتومتر بررسی شد. در ادامه، سیستم رونویسی معکوس با پرایمر رندوم هگزامر برای رونویسی معکوس RNA و سنتز cDNA مورداستفاده قرار گرفت. در پایان، سطح mRNA به‌وسیله تکنیک Real Time-PCR کمی شده qRT-PCR) ارزیابی شد. نتایج براساس فرمول 2-ΔCT آنالیز شده و به‌صورت بیان نسبی ژن که نسبت به میانگین ژن مرجع محاسبه شده‌اند، نشان داده شد.یافته‌ها: یافته‌های این پژوهش نشان داد که پس از القای درد التهابی، تزریق اورکسین A به داخل BLA میزان بیان ژن زیرواحدهای α3 و β2 گیرنده GABAA را کاهش می¬دهد. به دنبال القای درد التهابی با فرمالین، تزریق آنتاگونیست گیرنده‌های اورکسین نوع 1 (SB334867) و آنتاگونیست گیرنده¬های کانابینوئیدی نوع 1 (AM251) به آمیگدال قاعده‌ای-جانبی فقط بیان ژن زیرواحدهای α3 را کاهش داد. پیش‌تیمار آمیگدال قاعده‌ای-جانبی با SB334867 بیان ژن زیرواحدهای α3 و β2 گیرنده‌ GABAA را کاهش داد. با این حال، پیش‌تیمار BLA با AM251 و نیز پیش‌تیمار هم زمان BLA با SB33486 و AM251 میزان بیان ژن زیرواحدهای α2، α3 و β2 گیرنده‌های GABAAی موجود در BLA را به شدت کاهش داد. براساس یافته‌های این پژوهش پیشنهاد می شود که ممکن است تغییرات بیان ژن‌های زیرواحدهای α2، α3 و β2 گیرنده GABAA آمیگدال قاعده ای-جانبی در بی دردی ناشی از اورکسین A نقش داشته و توسط برهم‌کنش گیرنده‌های اورکسین نوع 1 و کانابینوئیدی نوع 1 میانجی‌گری شود. از سوی دیگر، احتمالا هر سه زیرواحد α2، α3 و β2 گیرنده GABAA نقش برابری را در اثر ضددردی اورکسین A در آمیگدال قاعده ای-جانبی ایفا می کنند. بنابراین، پیشنهاد می شود که ممکن است گیرنده های GABAA حاوی ترکیب زیرواحدی α3/α2β3γx موجود در نورون‌های آمیگدال قاعده ای-جانبی رت های نر بالغ در تعدیل درد التهابی ناشی از فرمالین نقش داشته باشند.

AbstractIntroduction: Pain is a warning phenomenon in order to provide the possibility of prevention, protection or treatment by warning of the existence or possibility of tissue damage. In the central nervous system, there are sevrel pain modulating pathways, which can be referred to as the Descending pain modulation pathway, stress-induced analgesia, and opioid and cannabinoid systems. Several studies have shown that the Descending pain modulation pathway originates from the central nucleus of the amygdala. The central nucleus of the amygdala also receives its input from the basolateral amygdala. In fact, the amygdala receives pain inputs from the thalamus, the primary somatosensory cortex, and the periaqueductal gray matter, and the inputs received from the PAG play a role in the downregulation of pain. The amygdala is a multinuclear structure of the forebrain and part of the limbic system, which plays a key role in understanding emotions, responding to sensory stimuli, processing emotions, emotions, and modulating pain. The basolateral amygdala receives orexin containing nerve fibrs from the lateral hypothalamus. Orexin A and B neuropeptides, released by orexinergic neurons in the lateral hypothalamus, activate intracellular signaling pathways by binding to their receptors. These peptides control various behaviors such as feeding, sleep-wake cycle, energy balance and pain modulation. Several reports show that the activation of type 1 orexin receptors causes the production of 2-arachidonyl glycerol , which retrogradely inhibits the release of GABA from presynaptic neurons and induces analgesia. Gamma-aminobutyric acid is the most important inhibitory neurotransmitter in the nervous system of vertebrates, which plays an important role in the coordination of local networks and the function of different brain nuclei. This neurotransmitter exerts its effect through GABAA, GABAb and GABAc receptors. GABAA receptors are composed of different subunits, whose expression is different in different areas of the central nervous system. According to these studies, the expression of α2، α3 و β2 subunits of this receptor has been shown in BLA amygdala. Therefore, in this study, the effect of orexin on the level of gene expression of α2، α3 و β2 subunits of GABAA receptors in the basolateral amygdala of adult male rats following the modulation of inflammatory pain was investigated with the help of qRT-PCR technique. Research Method: 84 Tissue samples of the BLA nucleus of male Wistar rats were divided into 12 groups including 7 rats. in this study. The quantitative Real Time-PCR technique (qRT-PCR) was used to evaluate the gene expression alterations of α2- and α3- and beta2 -subunits of GABAA receptor. Primarily, the total RNA was extracted from BLA nucleus samples, Then, the Extracted RNA purity was assessed by the spectrophotometer. Then, a reverse transcription system using random hexamer primer was utilized for RNA reverse transcription and cDNA synthesis. Finally, the mRNA levels were analyzed by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR). The results were evaluated using the 2-ΔCT method, analyzed to the average of the housekeeping gene and presented as relative gene expression.Findings: The findings of this study showed that after the induction of inflammatory pain, the injection of orexin A into the BLA decreases the gene expression of α2- and α3- and beta2 -subunits of GABAA receptor. Following induction of inflammatory pain with formalin, injection of orexin type 1 receptors antagonist (SB334867) and cannabinoid type 1 receptors antagonist (AM251) into the basolateral amygdala only decreased the gene expression of α3 subunits. Basolateral amygdala pretreatment with SB334867 decreased the gene expression of α3- and beta2 -subunits of GABAA receptor. However, pretreatment of BLA with AM251 and simultaneous pretreatment of BLA with SB334867 and AM251 greatly reduced the gene expression of α2- and α3- and beta2 -subunits of GABAA receptors present in BLA. Acording to the findings of this research, it is suggested that genes expression changes of α2- and α3- and beta2 -subunits of basal-lateral amygdala GABA receptor may play a role in orexin A induced analgesia and be mediated by the interaction of orexin type 1 and cannabinoid type 1 receptors. Furthermore, probably all three GABA receptor of α2- and α3- and beta2 -subunits play an equal role in the antagonizing effect of orexin A in the basolateral amygdala. Therefore, it is suggested that GABA receptors containing α3/α2β3γx subunit composition present in the basolateral amygdala neurons of adult male rats may play a role in the modulation of formalin induced inflammatory pain.

Basolateral nucleus of the amygdala, α2- and α3 and beta2 -subunits of GABAA receptors , Medulation of Pain,

‏ناصری،

فاطمه ‏

تهیه کننده

‏خاکپای،

خاکپای،

شانه بندی

رقیه ‏

‏فاطمه

داریوش ‏

استاد راهنما

استاد مشاور

استاد مشاور

‏تبریز