عنوان

بازسازی عصبی به واسطه تمایز سلول بنیادی مزانشیمی مشتق شده از اندومتر رحم انسان به سلول‌های شبه عصبی با استفاده از داربست پلی اکریلونیتریل / کیتوزان و بربرین در مدل آسیب عصب سیاتیک رت

پ۲۷۶۷۴

per

بازسازی عصبی به واسطه تمایز سلول بنیادی مزانشیمی مشتق شده از اندومتر رحم انسان به سلول‌های شبه عصبی با استفاده از داربست پلی اکریلونیتریل / کیتوزان و بربرین در مدل آسیب عصب سیاتیک رت

علی اصغر بستانی

علوم طبیعی

۱۴۰۱

۱۲۸ص.

سی دی

کارشناسی ارشد

زیست شناسی گرایش سلولی و مولکولی

۱۴۰۱/۰۶/۱۹

آسیب‌های عصبی یکی از ضایعات رایج در انسان محسوب می شوند. از پیشرفته‌ترین روش‌های جبران عوارض عصبی استفاده از مهندسی بافت عصبی است. مهندسی بافت عصبی به طور عمده بر پایه‌ی سلول‌ها، فاکتورهای رشد و پیشرفت بافت از طریق یک داربست مشابه با ماتریکس خارج سلولی که بتواند کشت سه بعدی سلولی را حمایت نماید، می‌باشد. هدف از این پژوهش استفاده از سلول-های شبه عصبی مشتق شده از سلول¬های بنیادی مزانشیمی آندومتر رحم انسان روی داربست پلی اکریلونیتریل / کیتوزان به همراه استفاده از بربرین در مدل آسیب عصب سیاتیک رت، جهت بازسازی عصب محیطی می¬باشد. در این پژوهش تجربی تمامی آزمایشات طبق اصول اخلاقی انجام گرفت. سلول‌های بنیادی مزانشیمی از اندومتر رحم انسان استحصال گردید و جهت تایید رده سلولی مزانشیمی، از فلوسایتومتری و تمایز به چربی و استخوان استفاده شد. در پاساژ سوم سلول‌های مزانشیمی، محیط کشت DMEM/F12 با محیط تمایز عصبی تعویض گردید. سلول‌ها به مدت 14 روز در محیط تمایزی نگهداری و بیان ژن های Nestin, MAP-2, Tuj-1, NF در سلول¬های تمایز یافته به واسطه RT-PCR و ایمونوسیتوشیمی تایید شدند. داربست نانوالیاف پلی اکریلونیتریل به روش الکتروریسی و داربست هیدروژل با پلیمرکیتوزان تولید شد. سلول¬ها روی داربست‌ها تمایز داده شدند تا به مدل حیوانی پیوند زده شوند.¬¬¬ در کنار مهندسی بافت عصبی، از داروی بربرین به¬صورت خوراکی نیز استفاده شد. بربرین ماده موثر ریشه گیاه زرشک می‌باشد و خواصی مانند آنتی بیوتیک و ضد التهابی را دارد. در این مطالعه از 25 راس رت بالغ نر استفاده شد و حیوانات به 5 گروه (1. گروه داربست و سلول و بربرین 2. گروه داربست و سلول 3. گروه داربست 4. گروه بربرین 5. گروه کنترل) تقسیم شدند. حیوانات به مدت 8 هفته تحت نظارت و نگهداری بودند و در آن مدت از تمام گروه‌ها تست شاخص عملکرد عصب سیاتیک (SFI) گرفته شد. درهفته هشتم بعد از عمل، با ایجاد برش در موضع قبلی، عصب سیاتیک قطع شد و نمونه‌ها جهت بررسی بافت شناسی آماده شدند. در این پژوهش سه رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین، لوکسال فست بلو و ایمنوهیستوشیمی، برای بررسی بافت شناسی استفاده شد. نتایج هفته هشتم تست SFI در گروه داربست 59/31-، گروه داربست و سلول 35/25-، گروه داربست و سلول و بربرین 08/24-، گروه بربرین 84/36- و گروه کنترل 27/39- گزارش شد. نتایج حاصل از بافت شناسی نشان داد که قطر عصب در گروه داربست 174 میکرومتر، گروه داربست و سلول 304 میکرومتر، گروه داربست و سلول و بربرین 591 میکرومتر، گروه بربرین 292 میکرومتر و گروه کنترل 80 میکرومتر می‌باشد. همچنین درصد تشکیل عصب جدید در گروه داربست و سلول و بربرین 5/18%، گروه داربست و سلول2/14%، گروه بربرین 1/6%، گروه داربست 2/4% و گروه کنترل 2/0% مشاهده شد. نتایج نشان داد استفاده از داربست و سلول به همراه بربرین می‌تواند تاثیر چشم گیری در بهبود عملکرد عصب سیاتیک نسبت به سایر گروه¬ها داشته باشد. نتایج ایمونوهیستوشیمی نشان داد که شدت رنگ سبز در گروه‌های دارای سلول بیشتر از گروه های فاقد سلول است و شدت رنگ سبز در گروه داربست و سلول و بربرین، به طور چشمگیری بیشتر از سایر گروه‌ها می باشد. همچنین در نتایج لوکسال فست بلو، همه گروه‌ها نسبت به گروه کنترل بهبود قابل ملاحظه‌ای داشت. در گروه کنترل تشکیل آکسون خاصی مشاهده نشد. در گروه داربست و سلول و بربرین، فیبر و آکسون‌ها متراکم‌تر، منظم تر و شدت رنگ آمیزی آبی بیشتر مشاهده شد. با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه سلول‌های مزانشیمی استحصال شده از اندومتر رحم انسان امکان تمایز کارامد به سلول‌های شبه عصبی را داشته و به کمک داربست پلی آکریلونیتریل/ کیتوزان و استفاده همزمان از داروی بربرین امکان ترمیم و بهبود آسیب عصب سیاتیک در مدل حیوانی رت را دارند.

Nerve injuries are one of the most common injuries in humans. One of the most advanced compensating neurological complications is neural tissue engineering. Neural tissue engineering is mainly based on cells, growth factors, and tissue development through a similar scaffold with an extracellular matrix that can support 3D cell culture. This research aims to use neuron-like cells derived from human endometrial mesenchymal stem cells on the polyacrylonitrile/chitosan scaffold and berberine in the rat sciatic nerve injury model for peripheral nerve regeneration. In this experimental research, all experiments were conducted according to ethical principles. Mesenchymal stem cells were extracted from the endometrium of the human uterus, and to confirm the mesenchymal cell line, flow cytometry and differentiation into fat and bone were used. In the third passage of mesenchymal cells, DMEM/F12 culture medium was replaced with a neural differentiation medium. The cells were maintained for 14 days in the differentiation medium, and the expression of Nestin, MAP-2, Tuj-1 and NF genes in the differentiated cells was confirmed by RT-PCR and immunocytochemistry. Polyacrylonitrile nanofiber scaffold was produced by electrospinning method and hydrogel scaffold with chitosan polymer. The cells were differentiated on the scaffolds to be transplanted into the animal model. Besides nerve tissue engineering, the berberine drug was also used orally. Berberine is the active substance of barberry root and has properties such as antibiotics and anti-inflammatory. In this study, 25 adult male Wistar rats were used. The animals were divided into five groups (1. Scaffold and cell and Berberine group, 2. Scaffold and cell group, 3. Scaffold group, 4. Berberine group, 5. Control group). The animals were monitored and maintained for eight weeks, and during that time, the sciatic nerve function index (SFI) test was taken from all groups. 8 weeks after the surgery, by making an incision in the previous position, the sciatic nerve was cut and the samples were prepared for histological examination. This study used hematoxylin-eosin, Luxal Fast Blue, and immunohistochemistry for histological examination. The results of the eighth week of the SFI test were reported in the scaffold group -31.59, the scaffold and cell group -25.35, the scaffold and cell and berberine group -24.08, the berberine group -36.84 and the control group -39.27. The histology results showed that the diameter of the nerve in the scaffold group was 174 micrometers, the scaffold and cell group was 304 micrometers, the scaffold and cell and berberine group was 591 micrometers, the berberine group was 292 micrometers, and the control group was 80 micrometers. Also, the percentage of new nerve formation in the scaffold and cell and berberine group was 18.5%, the scaffold and cell group was 14.2%, the berberine group was 6.1%, the scaffold group was 4.2%, and the control group was 0.2%. The results showed that the use of scaffolds and cells along with berberine could have a significant effect on improving the function of the sciatic nerve compared to other groups. The results of immunohistochemistry showed that the intensity of green color in the groups with cells is higher than the groups without cells, and the intensity of green color in the conduit and cell and berberine groups is significantly higher than other groups. Also, in the results of Luxal Fast Blue, all groups had significant improvement compared to the control group. No specific axon formation was observed in the control group. In the scaffold and cell and berberine group, fibers and axons were denser, more regular and blue staining intensity was observed. According to the results of this study, the mesenchymal cells extracted from the endometrium of the human uterus have the possibility of efficient differentiation into neural-like cells, and with the help of polyacrylonitrile/chitosan and berberine scaffolds, they have the possibility of repairing and improving sciatic nerve damage in the rat animal model.

Nerve Regeneration by Differentiation of Human Uterine Endometrial Derived Mesenchymal Stem Cells into Nerve-like Cells Using Polyacrylonitrile/Chitosan and berberine Scaffold in a Rat Sciatic Nerve Injury Model

‏‏بستانی،

‏‏علی اصغر

تهیه کننده

‏‏‏‏رازقی،

‏حویزی،

‏نداف،

‏جعفر

الهام

‏هادی

استاد راهنما

استاد راهنما

استاد مشاور

تبریز