عنوان

تأثیر لوتئولین روی عملکرد اسپرم قوچ نژاد قزل پس از فرآیند انجماد-یخ گشایی

پ۲۷۵۱۴

per

تأثیر لوتئولین روی عملکرد اسپرم قوچ نژاد قزل پس از فرآیند انجماد-یخ گشایی

خدیجه سلیمانی

کشاورزی

۱۴۰۰

۶۶ص.

سی دی

کارشناسی ارشد

علوم دامی، گرايش فیزیولوژی دام

۱۴۰۰/۰۶/۱۷

تلقیح مصنوعی گوسفند مزایای بسیاری برای بهبود ژنتیک گله دارد. حیوانات بومی هر منطقه ذخایر ژنتیکی آن منطقه بشمار می روند که در طی سالها با محیط خود سازگار شده و ژن‌های مطلوب در آنها ماندگار شده است. برای تلقیح گوسفندان نیاز به انجماد و انتقال اسپرم می باشد. با وجود پیشرفت‌های قابل توجه بدست آمده در زمینه‌ انجماد اسپرم، عملکرد و کیفیت اسپرم منجمد شده متاثر از تولید گونه‌های فعال اکسیژن و کاهش فعالیت آنتی‌اکسیدانی منی می باشد. اسپرم بعلت فراوانی اسیدهای چرب غیراشباع نسبت به پراکسیداسیون لیپیدی حساس است. غشاء پلاسمایی و سیتوپلاسم اسپرم توسط سیستم آنتی‌اکسیدانی پلاسمای منی محافظت می‌گردد. تولید مقادیر بیش‌ از حد رادیکال‌های آزاد در جریان انجماد باعث کاهش توان باروری اسپرم‌ها می‌گردد. این امر اساس استفاده از آنتی‌اکسیدان‌ها، برای بهبود بخشیدن به پروتکل‌های انجمادی است. مطالعات فارماکولوژیکی نشان می‌دهد که لوتئولین (3،4،5،7 تتراهیدروکسی فلاون) باعث محافظت از DNA اسپرم در برابر H2O2 شده و نقش آنتی‌اکسیدانی در پاکسازی رادیکال‌های آزاد دارد. لوتئولین از جمله شناخته ‌شده‌ترین ترکیبات فلاونوییدی است که در گیاهانی مانند روغن زیتون، نعناع، رزماری و مرزنجوش وجود دارد. فعالیت آنتی‌اکسیدانی لوتئولین در شرایط درون و برون تنی به اثبات رسیده است. لوتئولین دارای گروه‌های هیدروکسیل در موقعیت‌های 3، 4، 5 و 7 و یک پیوند مضاعف در موقعیت 2 است که مهمترین قسمت‌های ساختار آن محسوب شده و وظیفه انجام فعالیت‌های آنتی‌اکسیدانی در واکنش¬های ضدالتهابی و ضدسرطانی از طریق کنترل رادیکال‌های آزاد را بر عهده دارد. همچنین لوتئولین مستقیما رادیکال‌های آزاد مانند سوپراکسید آنیون و رادیکال‌های هیدروکسیل را از بین می‎برد. لوتتئولین موجب کاهش آسیب‌های ناشی از تنش اکسیداتیو به غشاء پلاسمایی می‌شود. لوتئولین اثرات مفیدی در رابطه با حفظ اسپرم دارد. هشت ﻗﻮچ ﻗﺰل با میانگین سن 2 الی 4 سال در ﺷﺮاﯾﻂ تغذیه‌ای و ﻣﺤﯿﻄـﯽ ﯾﮑﺴـﺎن ﺑـﺎ اﺳـﺘﻔﺎده از واژن ﻣﺼـﻨﻮﻋﯽ، دو بار در ﻫﻔﺘﻪ و در اواسط فصل بهار انجام شد. ابتدا نمونه‌های ﻣﻨﯽ قوچ‌ها از نظر ﺣﺠﻢ، رﻧﮓ، ﺗﺤـﺮك، ﻋـﺪم آﻟـﻮدﮔﯽ ﺑـﻪ ادرار و ﺧـﻮن و ﻣﯿﺰان اﺳﭙﺮم ﺑﺎ مرفولوژی ﻃﺒﯿﻌﯽ ﺑﺮرﺳﯽ شدند. ﺳﭙﺲ نمونه‌های با رنگ ﮐﺮﻣﯽ، ﺗﺤﺮك ﺑﯿﺸﺘﺮ از 70 درﺻـﺪ و اﺳـﭙﺮم ﻏﯿﺮﻃﺒﯿﻌﯽ ﮐﻤﺘـﺮ از 10 درﺻـﺪ بعنوان ﻣﻨﯽ ﻧﺮﻣﺎل در نظر گرفته ﺷﺪه در ﻏﯿﺮ اﯾن صورت، ﺣﺬف ﮔﺮدﯾﺪ. ﺑﺮاي از ﺑﯿﻦ ﺑﺮدن اﺛﺮات ﻓـﺮدي و اﺣﺘﻤـﺎﻻً اﺛـﺮات ﻣﺘﻘﺎﺑﻞ ﺑﯿﻦ نمونه‌ها، نمونه‌های ﻧﺮﻣﺎل باهم ﻣﺨﻠﻮط ﺷﺪﻧﺪ. نمونه های منی با رقیق کننده تریس-زرده تخم مرغ رقیق شده و سپس مقادیر صفر (تیمار شاهد(، 75/0 و 5/1، 3 و 6 میکرو‌مولار آنتی‌اکسیدان لوتئولین به آنها اضافه ‌شد. نمونه های رقیق شده طی دو ساعت تا دمای 4 درجه سانتیگراد ﺳﺮدﺳﺎزي شده و سپس در ﭘﺎﯾﻮتهای 25/0 میلی‌لیتری کشیده ﺷﺪﻧﺪ. پس از انجماد، نمونه ها تا زمان آزمایش در ﻧﻴﺘﺮوژن ﻣﺎﻳﻊ غوطه‌ور ﺷـﺪند. برای انجام ارزیابی¬ها، پایوت‌ها از ازت مایع خارج‌ نموده و در داخل بن ماری با دمای C°37 بمدت 30 ثانیه یخ‌گشایی شده و سپس فراسنجه های تحرک، زنده‌مانی، یکپارچگی غشاء پلاسمایی، میزان‌مالون‌دی‌آلدهید و اسپرم با مورفولوژی غیرطبیعی به ترتیب توسط سیستم کاسا، رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین، تست هیپواسموتیک، محلول هانکوک و سنجش میزان مالون دی آلدهید مورد ارزیابی قرار گرفتند. داده های بدست آمده با استفاده از روش GLM و با بکارگیری نرم افرار SAS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. نتایج بدست آمده نشان داد افزودن 3 میکرومولار آنتی‌اکسیدان لوتئولین سبب افزایش معنی‌دار تحرک کل و پیش‌رونده گردید، همچنین 5/1 و 3 میکرومولار سبب افزایش پارامتر VCL نسبت به گروه کنترل گردید. افزودن 3 میکرومولار به محیط انجماد سبب افزایش معنی‌دار فراسنجه‌های زنده‌مانی، یکپارچگی غشای پلاسمایی اسپرم و همچنین کاهش میزان مالون‌دی‌آلدهید و اسپرم‌های با مورفولوژی غیرطبیعی گردید. نتایج این مطالعه نشان داد که افزودن لوتئولین بعنوان آنتی‌اکسیدان به محیط رقیق کننده اسپرم قوچ طی انجماد و یخ‌گشایی اثرات سودمندی روی فراسنجه‌های مورد ارزیابی داشت.

Abstract: Artificial insemination in sheep has many benefits for genetic improvement of herd. The native animals of each region are the genetic resources of that region that have adapted to their environment over the years and the desired genes have been retained in them. Insemination of sheep requires freezing and transfer of semen. Despite significant advances in semen cryopreservation, the function and quality of frozen sperm are affected by the production of reactive oxygen species and reduction of semen's antioxidant activity. Sperm is sensitive to lipid peroxidation due to the abundance of unsaturated fatty acids. Plasma membrane and cytoplasm of sperm are protected by the seminal plasma antioxidants. Excessive production of free radicals during freezing reduces the sperm fertility. This is the basis of the antioxidants supplementation to improve cryopreservation protocols. Pharmacological studies show that Luteolin (3, 4, 5, 7 tetrahydroxyflavone) protects sperm DNA against H2O2 and it has an antioxidant role in scavenging free radicals. Luteolin is one of the most well-known flavonoid compounds found in plants such as olive oil, mint, rosemary and marjoram. The antioxidant activity of Luteolin has been proven in vitro and in vivo. Luteolin has hydroxyl groups at positions 3, 4, 5, and 7 and a double bond at position 2, which are the most important parts of its structure and are responsible for antioxidant activity in anti-inflammatory and anti-cancer reactions by controlling free radicals. Luteolin also directly scavenges free radicals such as anion superoxide and hydroxyl radicals. Lutteolin reduces damage to plasma membranes due to oxidative stress. Luteolin has beneficial effects on sperm retention. Eight Ghezel ram with average age of 2 to 4 years were used in this study. Semen collection was performed twice a week using an artificial vagina in middle of spring. The rams were kept in identical nutritional condition. At first, semen samples were examined for volume, color, urinary and blood contamination, motility and morphology of sperm. Samples in cream color, sperm motility more than 70% and abnormality less than 10% are considered as the normal semen sample. In order to eliminate the individual effects of rams, the semen samples were pooled together. Semen diluted with tris-egg yolk extender that contain different concentration of Luteolin (Zero (control treatment), 0.75, 1.5, 3 and 6 μM). Samples were cooled to 4ᵒC at two hours. The samples were filled in 0.25ml straws. After freezing, straws were stored in nitrogen tank until evaluation. In order to evaluate, after thawing the samples in water bath with 37ᵒC at 30S, the sperm motility parameters, viability of sperms, plasma membrane integrity, sperm abnormalities and lipid peroxidation were evaluated. Using CASA system, Eosine-Nigrosin stain, hypo osmotic swelling test, Hancock solution and measuring of malondialdehyde concentration, respectively. Data were analyzed using GLM procedure of SAS software. Results showed that the addition of 3 μM antioxidant luteolin significantly increased total and progressive motility, also 1.5 and 3 μM increased the VCL parameter compared to the control group. Addition of 3 μM to the freezing extender significantly increased the viability, plasma membrane integrity of sperms and decreased the amount of malondialdehyde and sperm with abnormal morphology. The results of this study showed that the addition of luteolin as an antioxidant to the extender of ram semen during freeze-thawing had beneficial effects on the evaluated parameters.

Effects of Luteolin on Ghezel ram semen after freeze-thawing process

‏سلیمانی،

‏خدیجه

تهيه کننده

‏دقیق کیا،

مقدم،

ابراهیمی،

‏حسین

‏ غلامعلی

‏ مرضیه

استاد راهنما

استاد مشاور

استاد مشاور

‏ تبریز