عنوان

ارزیابی مولکولی و بلوغ فولیکول‌های پره‌آنترال موش در سیستم کشت سه بُعدی با استفاده از هیدروژل کیتوزان در مقایسه با هیدروژل آلژینیت

۹۳۹۰۰پ

فارسی

فارسی

ارزیابی مولکولی و بلوغ فولیکول‌های پره‌آنترال موش در سیستم کشت سه بُعدی با استفاده از هیدروژل کیتوزان در مقایسه با هیدروژل آلژینیت

[پایان نامه]

فاطمه حسنی

دانشگاه علوم پزشکی تهران، دانشکده پزشکی

۱۳۹۷

۱۰۴ص.

جدول نمودار

سی دی

دکتری تخصصی(PHD)

بیولوژی تولیدمثل

مقدمه: کشت فولیکول‌های منفرد به روش دو بُعدی و سه بُعدی، جایگزینی مناسب برای پیوند بافت تخمدان است. با وجود مطالعات گسترده طی سال‌های گذشته، هنوز روشی استاندارد و مورد توافق همه، برای کشت سه بُعدی فولیکول، حتی در مدل‌‌‌‌‌‌ های موشی نیز وجود ندارد. هدف از این مطالعه، بررسی بیومتریال جدید برای کشت سه بُعدی فولیکول‌های تخمدانی موش است که منجر به مدلی برای حمایت از انسجام فولیکول طی کشت آزمایشگاهی شود. مطالعه‌ی حاضر، اولین کاربرد هیدوژل کیتوزان را برای کشت سه بُعدی فولیکول‌های پره‌آنترال موش گزارش می‌کند. مواد و روش‌ها: این مطالعه در دو فاز طراحی شد. در فاز اول ابتدا هیدروژل کیتوزان در سه غلظت 5/0، یک و 5/1 درصد تهیه شد. سپس به منظور دستیابی به غلظت مناسب این هیدروژل، ارزیابی‌های ریخت شناسی شامل FTIR(Fourier Transform Infrared) و تصاویر میکروسکوپ الکترونی، ارزیابی های مکانیکی شامل ویسکوزیته، نرخ تجزیه‌پذیری، نرخ تورم، استحکام مکانیکی، آزمون MTT و زنده‌مانی بر روی این سه غلظت انجام شد. در فاز دوم پس از مشخص شدن غلظت مناسب هیدروژل کیتوزان ارزیابی‌های بیولوژیک در این غلظت انتخابی در مقایسه با آلژینیت انجام شد. برای انجام فاز دوم مطالعه از موش‌‌های سوری نژاد NMRI استفاده شد. فولیکول‌های پره‌آنترال انکپسوله شده در غلظت انتخابی هیدروژل کیتوزان و هیدروژل آلژینیت (غلظت 7/0 درصد) در محیط αMEM حاوی FSH, ITS و FBS پنج درصد، به‌مدت سیزده روز کشت داده شدند. در این مرحله نرخ تشکیل حفره آنتروم، قطر و زنده مانی فولیکول ها ارزیابی شد. سپس به‌منظور ازسرگیری میوز و بلوغ تخمک‌ها، hCG به محیط کشت اضافه شد. نرخ تخمک متافاز II و کیفیت تخمک‌های بالغ شده توسط رنگ‌آمیزی ایمینوسیتوشیمی بررسی شد. بیان ژن‌های فولیکوژنزیس Ggf9, Bmp15, Zp3, Cx37, Cx43, Bmp4 Bmp7 ، استروئیدوژنزیس Cyp19a1, Cyp11a1, Cyp17a1, FSH receptor (Fshr) و آپوپتوزیس Bax, Bcl2 , Casp3, P53،Bax/Bcl2 در فولیکول‌های آنترال حاصل از کشت سه بُعدی در هر دو گروه و با فولیکول‌های پره‌آنترال روز صفر به عنوان گروه کنترل با کمک تکنیک q-RT-PCR مقایسه شدند. همچنین ترشح هورمون‌های استروئیدی توسط کیت الیزا در هر دو گروه در روز صفر و سیزده با یکدیگر مقایسه شدند نتایج: نرخ تورمی بالاتر کیتوزان 5/0درصد در مقایسه با کیتوزان یک درصد و مقایسه‌ی تصاویر میکروسکوپ الکترونی نشان از قدرت مکانیکی ضعیف این هیدروژل داشت. کیتوزان یک درصد نسبت به 5/1 درصد دارای توزیع منافذ یکنواخت و نرخ تورمی بالاتری است. غلظت نیم درصد به‌دلیل ویسکوزیته پایین و غلظت 5/1 درصد نیز به‌دلیل ویسکوزیته‌ی بالا مناسب کشت فولیکول تخمدانی نبودند بنابراین غلظت انتخابی برای انجام فاز دوم مطالعه و مقایسه با هیدروژل آلژینیت کیتوزان یک درصد است نرخ زنده‌مانی فولیکول‌ها طی کشت آزمایشگاهی با حضور تخمک سالم ارزیابی شد. نرخ زنده‌مانی در کیتوزان یک درصد به‌طور ‌معناداری بیشتر از آلژینیت بود (p < 0.05). نرخ تشکیل حفره آنتروم در گروه کیتوزان نسبت به آلژینیت افزایش داشت، ولی اختلاف ‌معناداری را نشان نداد. قطر فولیکول‌ها در گروه کیتوزان یک درصد نسبت به آلژینیت در روزهای ششم و سیزدهم کشت ‌به‌طور ‌معناداری افزایش نشان داد(p < 0.05). تخمک ‌‌‌‌های حاصل از گروه آلژینیت نسبت به گروه کیتوزان نرخ GV بیشتر و GVBD کمتری را نشان دادند. نرخ MII در گروه کیتوزان بالاتر بود، ولی اختلاف ‌معناداری را نشان نداد. دوک میوزی نرمال و آرایش کروموزوم‌ها در گروه کیتوزان و کنترل بالاتر از گروه آلژینیت بود و اختلاف ‌معناداری را نشان داد(p < 0.05). توزیع نرمال گرانول های قشری در گروه کنترل بالاتر از گروههای آزمایشی بود و اختلاف معنی داری را نشان داد(p < 0.05). بیان ژن‌های فولیکوژنزیس، استروئیدوژنزیس و آپوپتوزیس در هر دو گروه کیتوزان و آلژینیت نسبت به گروه کنترل، الگوی بیان مشابهی را نشان دادند. بیان ژن‌های Cyp19a1 (5/1 برابر) و Lhcgr (8/1 برابر) در گروه کیتوزان ‌به‌طور ‌معناداری بالاتر از گروه آلژینیت بود (p < 0.05). بیان ژن Fshr در گروه کیتوزان نسبت به گروه آلژینیت، کاهش ‌معناداری را نشان داد (p < 0.05). ترشح استرادیول در گروه کیتوزان بالاتر از گروه آلژینیت بود و اختلاف ‌معناداری را نشان داد (p < 0.05) ولی ترشح پروژوسترون با وجود افزایش بیشتر در گروه کیتوزان اختلاف ‌معناداری را نشان نداد. نتیجه گیری: نتایج مطالعه‌ی حاضر نشان می‌دهد که کیتوزان هیدروژلی قابل قبول است و برای انکپسوله کردن فولیکول‌های تخمدانی، کشت سه بُعدی آن و تکوین بعدی فولیکول مناسب است.

کیتوزان

آلژینیت

هیدروژل

فولیکول تخمدانی

سیستم کشت سه بعدی

پیوند بافت تخمدان

بررسی بیومتریال

FTIR (Fourier Transform Infrared)

نژاد NMRI

ایمینوسیتوشیمی

بیان ژن Fshr

3D (three-dimensional) system

Chitosan

Alginate

Hydrogel

Ovarian follicle

3D culture

biocompatibility

Testing of novel biomaterials

Immunocytochemistry

orthotropic grafting

Individual follicle culture

دستیابی به غلظت مناسب

ارزیابی‌های بیولوژیک

کشت آزمایشگاهی

culture model

novel CS hydrogel

۳-D culture

، پدیدآور

حسنی، فاطمه

، استاد راهنما

، استاد راهنما

، استاد مشاور

، استاد مشاور

حسن زاده، غلامرضا

رضازاده ولوجردی، مجتبی

ابراهیمی، بی تا

معینی، اشرف

دانشگاه علوم پزشکی تهران، دانشکده پزشکی

ایران

20230503

۱۷۹۲ف

دانشگاه علوم پزشکی تهران، کتابخانه دانشکده پزشکی

p

TF

92029

a

Y