عنوان
پدید آورنده
موضوع
رده
کتابخانه
محل استقرار
۹۳۰۱۶پ
فارسی
فارسی
بهینه سازی بیان فرم محلول موتانت توکسین دیفتری CRM197 با استفاده از روش طراحی آژمایش Experimental design خالص سازی با روش کروماتوگرافی میل ترکیبی و بررسی میزان خلوص و سمیت آن
[پایان نامه]
مهسا پیله وری
دانشگاه علوم پزشکی تهران، دانشکده پزشکی
1396
86ص.
جدول نمودار
سی دی
کارشناسی ارشد
بیوشیمی بالینی
پروتئین به عنوان فرم جهش یافته و غیرسمی سم دیفتری امروزه به طور گسترده در تهیه واکسن‌های کونژوگه پلی‌ساکاریدی علیه هموفیلوس آنفولانزا تیپb و مننگوکوک به عنوان پروتئین حامل بکارگرفته میشود. سایر کاربردهای آن در عرصه بالین نظیر قابلیت استفاده از آن به عنوان آنتی ژن در تولید واکسن علیه بیماری دیفتری، اثر آنتی‌توموری و توانایی آن در انتقال دارو به مغز به دفعات در مطالعات بنیادی مورد بررسی و تایید قرار گرفته‌است.هدف مطالعه: در مطالعه حاضر، روش طراحی آزمایش (Experimental Design) با هدف بهینه‌سازی بیان فرم محلول موتانت سم دیفتری (CRM197) بکار گرفته میشود و در ادامه پس از خالص‌سازی پروتئین بیان شده با روش كروماتوگرافي ميل تركيبي، سمیت آن بر روی سلول های vero بررسی میشود.مواد و روش¬ها: در کار حاضر، پلاسمید pET28a حامل ژن بیان کننده‌ی پروتئین CRM197 به همراه دنباله‌ی هیستیدینی به سویه‌های BL21 (DE3) و Rosetta-Gami (DE3) باکتری اشریشیاکلای منتقل شد و بیان آن توسط سیستم بیانی مذکور با استفاده از تکنیک وسترن بلاتینگ مورد تایید قرار گرفت. به منظور بهینه سازی میزان بیان پروتئین نوترکیب و محلول CRM197، در گام نخست با استفاده از طراحی عاملی جزئی(fractional factorial design) اثرگذاری پنج متغیر: نوع سویه میزبان بیانی (سویه‌های BL21 (DE3)، Rosetta-Gami (DE3) )(، نوع محیط کشت (LB و SB)، دمای القا (C˚37-˚C15)، غلظت القاکننده IPTG (05/0 تا 2 میلی‌مولار) و غلظت آنتی‌بیوتیک کانامایسین (10 تا 200 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) بر روی میزان بیان بررسی شد. به دنبال شناسایی متغیرهای تاثیرگذار بر میزان بیان، بهینه سازی آن ها توسط روش آماری Box-Behnken انجام شد و مقدار بهینه برای هریک از متغیرها تعیین گردید. در مرحله نهایی بهینه سازی، به منظور تایید شرایط بهینه مشخص شده نقاط بهینه حاصل، پنج بار تکرار شد. در تمامی مراحل، بررسی میزان پروتئین بیان شده به کمک تکنیک وسترن بلاتینگ صورت گرفت. پروتئین CRM197 ، تحت شرایط بهینه در مقیاس بالا (دو لیتر) بیان و به واسطه حضور دنباله هیستسدینی در انتهای آمینی آن توسط کروماتوگرافی تمایلی تخلیص گردید. در انتها به منظور بررسی اثر سمیت پروتئین CRM197، رقت های سریالی مختلفی از پروتئین تخلیص شده در مجاورت سلول های Vero قرار گرفت.نتایج: داده های حاصل از مرحله غربالگری نشان دهنده تاثیرگذاری نوع محیط کشت، دمای القا، غلظت القاکننده IPTG و آنتی بیوتیک کانامایسین بر روی میزان بیان محلول پروتئین CRM197 میباشد، در حالی که نوع سویه بیانی بر روی میزان بیان اثر چشمگیری ندارد. در مرحله ی بهینه سازی با استفاده از طراحی Box-Behnken و استفاده از محیط کشت SB، مقادیر بهینه پارامترهای موثر به شرح زیر حاصل شد: غلظت القاکننده IPTG (4/0 میلی‌مولار)، غلظت آنتی بیوتیک کانامایسین ( 97 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) و دمای القا (C˚20). تایید خلوص پروتئین با بکارگیری روش کروماتوگرافی میل ترکیبی به کمک تکنیک SDS-PAGE، انجام گرفت. با بررسی اثر سمیت پروتئین تخلیص شده CRM197 بر روی سلول های Vero، عدم سمیت آن تا غلظت μg/ml1000 تایید شد.نتیجه¬گیری: طبق نتایج حاصل از این مطالعه، شرایط بهینه به منظور دستیابی به بیشترین میزان بیان فرم محلول پروتئین نوترکیب CRM197، تعیین و خالص‌سازی آن انجام شد. هم¬چنین عدم سمیت پروتئین تخلیص شده در غلظت μg/ml1000 تایید شد.
استفاده بهینه
Optimization*
a10
a10
پروتئین نوترکیب CRM197
بهینه سازی
طراحی آزمایش
خالص سازی
، پدیدآور
پیله وری، مهسا
، استاد راهنما
، استاد مشاور
امینیان، مهدی
خوشایند، محمدرضا
دانشگاه علوم پزشکی تهران، دانشکده پزشکی
ایران
20230514
1672ف
دانشگاه علوم پزشکی تهران، کتابخانه دانشکده پزشکی
p
TF
92029
a
Y
